牛結(jié)核γ-干擾素

ELISA試驗(yàn)操作規(guī)程

SOP序號：REAL-011

編制人員：曹瑞

青島瑞爾生物技術(shù)有限公司

2014-01-01

牛結(jié)核γ-干擾素ELISA試驗(yàn)操作規(guī)程

1. 簡介

1.1 適用范圍

本試驗(yàn)用于檢測牛全血培養(yǎng)上清中的牛γ-干擾素，根據(jù)檢測牛PPD、禽PPD和PBS刺激全血后上清中γ-干擾素量的不同，從而判斷牛結(jié)核的感染情況。

1.2 試驗(yàn)背景

牛γ-干擾素試驗(yàn)是以刺激培養(yǎng)全血為基礎(chǔ)，檢測牛結(jié)核病的***種試驗(yàn)方法。通常，感染分支桿菌的牛，其血液中的淋巴細(xì)胞能識別特異的分支桿菌抗原（包括結(jié)核菌素PPD），淋巴細(xì)胞識別分支桿菌抗原的過程涉及細(xì)胞因子的產(chǎn)生和釋放，γ-干擾素就是其中zui重要的***種。用結(jié)核菌素(PPD)刺激培養(yǎng)牛全血，全血中的T淋巴細(xì)胞就會識別PPD，發(fā)生細(xì)胞免疫反應(yīng)，其中***個直接的表現(xiàn)就是產(chǎn)生并釋放γ-干擾素。γ-干擾素可用γ-干擾素特異的單克隆抗體夾心法檢測。

其它資料背景參考《牛γ-干擾素ELISA檢測試劑盒》的說明書。

2. 安全性

2.1 所有操作步驟都應(yīng)符合當(dāng)?shù)氐摹拔ｋU物質(zhì)控制規(guī)范”

2.2 此試驗(yàn)存在***定風(fēng)險，盡管風(fēng)險比較小。陽性反應(yīng)的上清中可能會含有分支桿菌，因此所有操作步驟都應(yīng)遵循下面的操作規(guī)程。

3. 材料

3.1 試劑

牛γ-干擾素ELISA檢測試劑盒(青島瑞爾生物技術(shù)有限公司提供)，滅菌的去離子水（溶解試劑盒內(nèi)物質(zhì)）。

3.2 試驗(yàn)耗材

1ml與200μl吸頭（無菌）、生物安全口罩、高壓滅菌袋、乳膠手套、消毒劑、記號筆、吸水紙、便簽紙。

3.3 儀器設(shè)備

酶標(biāo)儀（含450nm）、單道移液器（0-1000μl，0-200μl）、8-12多道移液器、移液槽、振蕩器、計時器。

4. 操作程序

4.1 試劑準(zhǔn)備

4.1.1 ELISA板

未開封前，在室溫平衡至少1小時。

4.1.2 陰陽性對照

用無菌蒸餾水或去離子水溶解，確保完全溶解，溶解后的陰陽性對照可在2-8°C保存3個月。使用前恢復(fù)至室溫，并充分混勻。

4.1.3 洗液

使用前恢復(fù)至室溫，用蒸餾水或去離子水20倍稀釋。

4.1.4 稀釋液

直接使用，使用前恢復(fù)至室溫，主要用于稀釋酶標(biāo)結(jié)合物。

4.1.5 結(jié)合物

用稀釋液50倍稀釋，現(xiàn)用現(xiàn)配，適量配制。

4.1.5 TMB

直接使用，使用前恢復(fù)至室溫。

4.1.6 終止液

直接使用，使用前恢復(fù)至室溫。

4.2注意事項(xiàng)

4.2.1 實(shí)驗(yàn)前除結(jié)合物外，其它試劑與試驗(yàn)樣品必須恢復(fù)至室溫。

4.2.2 試劑盒所有試劑需2-8℃保存，用完后應(yīng)立即放回2-8℃保存。

4.2.3 用無菌蒸餾水或去離子水充分溶解凍干物質(zhì)，溶解后平衡至少15分鐘，

使用前混勻。

4.2.4 待檢上清應(yīng)先加到稀釋板，然后用8道或12道的移液器轉(zhuǎn)到ELISA板上，保證加入的上清孵育時間***致。

4.2.5 陰性和陽性γ-干擾素對照品和空白對照每次應(yīng)加入到固定孔中，在第H行的10，11和12孔。

4.2.6 每個板條應(yīng)做好標(biāo)記，并適當(dāng)固定板條，以防板條從板框中脫落，或防止脫落后板條順序混亂不清，對檢測造成不必要的麻煩。

4.2.7 未用完的板條應(yīng)放入含干燥劑的自封袋中2-8℃保存。如果保存得當(dāng)可保存至有效期止。不可混用不同批次試劑盒的板條。

4.3 操作步驟

4.3.1 試驗(yàn)前將所有試劑（除結(jié)合物）恢復(fù)至21°C +/- 3°C。

4.3.2 溶解凍干試劑，并平衡15 分鐘。

4.3.3 每孔加入100μL 待檢樣品（不需稀釋）和對照品（陽性、陰性和空白對照各***孔，陰性對照加入到H10孔，陽性對照加入到H11孔，空白對照H12孔）至相應(yīng)孔中。在微量振蕩器上振蕩1min，徹底混勻。

4.3.4 封板，室溫（21±3℃）孵育1 小時。

4.3.5 洗滌4 次。洗液按配制方法制備，洗滌方法如下：迅速翻轉(zhuǎn)ELISA 板以倒空其內(nèi)液體，避免孔與孔之間的液體混合，每孔中添加300 μl 的洗液，輕搖微

孔板，避免造成不同孔間的污染，迅速翻轉(zhuǎn)ELISA 板以倒空其內(nèi)液體，重復(fù)操作3 次。第4 次洗滌完畢后，將酶標(biāo)板放在干凈的濾紙上拍打幾次，盡量除去殘留的洗液。

4.3.6 每孔加入100μL 新鮮配制的酶標(biāo)結(jié)合物，充分振蕩混勻。按表1 稀釋液稀釋酶標(biāo)結(jié)合物。

4.3.7 封板，室溫（21±3℃）孵育1 小時。

4.3.8 洗滌4 次。洗滌方法同4.3.5。

4.3.9 每孔加入100μL 底物溶液（TMB），充分振蕩混合。

4.3.10 封板，21±3℃避光孵育10min。注釋：可根據(jù)顏色反應(yīng)的強(qiáng)度延長或縮短孵育時間。

4.3.11 每孔加入50μL 終止液，輕輕搖動混勻。

4.3.12 終止后5min 內(nèi)讀取OD450nm 的值。

5. 結(jié)果

結(jié)果包括分析試驗(yàn)的有效性和試驗(yàn)結(jié)果的分析。

試驗(yàn)的有效性

5.1 陽性對照OD值>0.700 ，否則試驗(yàn)視為失敗，需重新檢測。

5.2 陰性對照OD 值<0.150 ，否則試驗(yàn)視為失敗，需重新檢測。

結(jié)果的解釋

當(dāng)進(jìn)行重復(fù)孔時,OD 值的計算需取平均值。

5.3 陽性＝牛PPD－PBS≥0.1（OD值） 且牛PPD －禽PPD≥0.1（OD值）。

5.4 陰性＝牛PPD－PBS<0.1（OD值） 或 牛PPD－禽PPD<0.1（OD值）。

5.5 任何的試驗(yàn)偏差，不正常的組份（如加入TMB后出現(xiàn)沉淀），操作規(guī)程中描述的出錯等都應(yīng)及時反饋給主管經(jīng)理并出具書面報告。任何的偏差均可能會造成結(jié)果錯誤和不可信，因此應(yīng)及時反饋通知，協(xié)商解決。

6. 參考文獻(xiàn)

[1] Wood PR, Rothel JS, McWaters PGD, Jones SL. Production and characterisation of monoclonal antibodies specific for bovine gamma interferon. Vet Immunol Immunopath, 25:37-46(1990).

[2] Wood PR, Corner LA, Plackett P. Development of a simple, rapid in vitro cellular assay for bovine tuberculosis based on the production of IFN-γ:Res Vet Sci,49:46:49(1990).

[3] Wood PR, Corner LA, Rothel JS, Baldock C, Jones SL, Coisins DB, McCormick BS, Francis BR, Creeper J, Tweddle NE. Field comparison of the interferon-gamma assay and the intradermal tuberculin test for the diagnosis of bovine tuberculosis. Aust Vet J, 68:286-290(1991).

注：文章來源于互聯(lián)網(wǎng)